摘要

底物特異性是表征酶的一個關(guān)鍵參數(shù)，它直接關(guān)系到酶的應(yīng)用潛力。商品化的Lecitase Ultra已被廣泛用于石油脫膠過程中，以特異性水解原油中的磷脂，但其對各種磷脂的特異性仍不清楚。在本研究中，采用單層技術(shù)，在不同的表面壓力條件下表征了超乳糖酸酶對不同種類磷脂的選擇性。超乳糖酸酶對各種磷脂的水解活性高度依賴于單層膜的表面壓力。在相同的表面壓力（25mN/m）下，在所有磷脂單層膜的液體冷凝狀態(tài)下，超卵磷脂酶對不同單分子磷脂膜的偏好順序?yàn)镻E>CL>PS>PI>PC。在測試的表面壓力范圍內(nèi)，未觀察到鞘磷脂的水解活性。目前的研究提供了關(guān)于Lecitase Ultra對各種磷脂的選擇性偏好順序的基本信息，這是以前未知的，并為更好地利用這種酶在石油工業(yè)中提供了額外的信息。

實(shí)際應(yīng)用

據(jù)我們所知，我們已經(jīng)報(bào)道了應(yīng)用單層技術(shù)研究超乳糖酸酶對各種天然磷脂的底物選擇性。這項(xiàng)研究直接有助于該酶在工業(yè)中的應(yīng)用。此外，我們試圖證明單層技術(shù)對于評估某些天然底物的酶活性是非常有效和簡單的，并且應(yīng)該在界面酶工程領(lǐng)域做出更大的貢獻(xiàn)。

圖形摘要

利用單層技術(shù)表征超乳糖酸酶對不同磷脂的界面催化性能。

1、介紹

Lecitase Ultra是藍(lán)綠假單胞菌脂肪酶（TLL）和尖孢鐮刀菌脂肪酶（FOL）的嵌合體[1]，具有相當(dāng)高的磷脂酶活性和脂肪酶活性[2]。這種酶完全基于其磷脂酶活性，能夠水解油中的磷脂，并通過形成溶血磷脂和甘油磷脂將其去除，從而成功地用于植物油的脫膠[3,4]。正如我們所知，不同來源的原油中磷脂的組成和含量存在顯著差異：例如，原油中的卵磷脂通常含有20%的磷脂酰膽堿（PC）、15%的磷脂酰乙醇胺（PE）、20%的磷脂酰肌醇（PI）、5%的磷脂酸（PA）和其他磷脂[5]。因此，Lecitase Ultra對不同磷脂的選擇性是實(shí)際應(yīng)用中的一個重要參考指標(biāo)，這反過來又與應(yīng)添加的酶量以及脫膠過程中所需的反應(yīng)時間直接相關(guān)。因此，獲得這種酶對天然磷脂的選擇性信息尤為重要。然而，仍然缺乏對這方面的深入了解。

脂肪酶作為一種界面酶，催化不溶性底物與水之間的界面水解反應(yīng)[6]。因此，脂肪分解的催化反應(yīng)與各種界面現(xiàn)象有關(guān)，并強(qiáng)烈依賴于界面上存在的脂質(zhì)基質(zhì)的結(jié)構(gòu)組織[6-8]。為了獲得有關(guān)酶對各種磷脂選擇性的適當(dāng)信息，選擇合適的測試方法至關(guān)重要，應(yīng)該是首要考慮的問題。

單層技術(shù)是研究空氣/水界面上酶-脂質(zhì)相互作用的最通用的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，已被用于通過相對表面活性來比較脂肪酶的底物選擇性[9]。使用單層技術(shù)進(jìn)行酶表征有幾個優(yōu)點(diǎn)。首先，底物和酶只需要少量的物質(zhì)。因此，我們可以以非常低的成本獲得酶的活性信息。其次，可以改變表面組分的分子堆積，并且可以連續(xù)監(jiān)測脂質(zhì)或蛋白質(zhì)從界面的釋放或轉(zhuǎn)移到界面的情況。第三，與傳統(tǒng)的pH-stat方法相比，該方法的高靈敏度已通過實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證[10,11]。最后，反應(yīng)的物理化學(xué)參數(shù)，如溫度、側(cè)壓、分子密度、離子條件等，可以在很寬的范圍內(nèi)方便地改變，并且可以以?精度分析結(jié)構(gòu)[12]。因此，單分子層是研究界面酶反應(yīng)的合適模型。到目前為止，不同種類的脂肪酶，甚至磷脂酶（包括磷脂酶A2、C和D）已經(jīng)通過使用這種方法進(jìn)行了表征[11-14]。

本文首次采用單層技術(shù)對商品化超乳糖酸酶的底物選擇性進(jìn)行了表征。目前的結(jié)果不僅提供了對酶底物選擇性的透徹理解，而且為酶在石油工業(yè)中的具體用途提供了詳細(xì)信息。

2、材料和方法

2.1材料

商業(yè)Lecitase Ultra由丹麥巴格斯瓦爾德諾維信A/S提供，直接測試，無需進(jìn)一步純化。L-α-磷脂酰肌醇（PI，純度≥1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-絲氨酸（PS，純度≥97%），L-α-磷脂酰乙醇胺（PE，純度≥1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（PC，純度≥97%），心磷脂（CL，純度）≥鞘磷脂（SM，純度）≥98%）和β-環(huán)糊精從Sigma-Aldrich（密蘇里州圣路易斯）購買。HPLC級氯仿購自凱美爾化學(xué)試劑有限公司（天津）。使用Millipore（馬薩諸塞州貝德福德）Milli-Q水系統(tǒng)凈化水。所有其他攝政王都是分析級的。

2.2單分子薄膜實(shí)驗(yàn)

2.2.1表面壓力-面積等溫線

使用帶有Langmuir-Teflon槽（206 mm×59 mm）的商用單層系統(tǒng)（芬蘭赫爾辛基Kibron的微槽X）和兩個屏障的對稱壓縮，記錄不同磷脂單層的壓縮等溫線。實(shí)驗(yàn)在室溫（25℃）下進(jìn)行。通過使用microsyringe（Hamilton Co.，Reno，NV）將不同磷脂的氯仿儲備溶液滴在50 mM檸檬酸緩沖液（pH 5.0）亞相上形成單層（Hamilton Co.，Reno，NV）。15分鐘后，以2.5 mm/min的速率連續(xù)壓縮所需組合物的單層。表面壓力是用附著在表面的金屬絲探針測量的。連續(xù)記錄表面壓力與表面積（π-A）等溫線。只要需要，膠片就被壓縮到崩潰壓力。每次運(yùn)行重復(fù)三次，保持π-A等溫線的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4?2。

2.2.2使用一個"零級"槽（由一個圓形反應(yīng)室和兩個儲液室（182mm×40mm）組成）進(jìn)行了Lecitase Ultra的動力學(xué)水解活性計(jì)算。反應(yīng)室的直徑為21 mm，面積為346 mm2。這兩種隔室通過一個小的表面通道（寬0.5厘米）相互連接。該方法的原理之前由Verger和De Haas[15]描述。在目前的工作中，用毫Q水制備50 mM檸檬酸緩沖液（pH 5.0），并通過0.45μm微孔膜過濾。在50 mM檸檬酸緩沖液（pH 5.0）亞相上涂抹幾微升氯仿磷脂溶液，直到達(dá)到所需的初始表面壓力（πi），制備單層。由恒壓器自動驅(qū)動的移動式屏障在儲層上來回移動，以壓縮并保持表面壓力（π）恒定。為了確保水解反應(yīng)中產(chǎn)生的長鏈脂肪酸能夠溶解在水中，按照Mosbah等人的建議，將β-環(huán)糊精（0.6 mg/ml）注入反應(yīng)室。[10]。然后將10μL酶溶液注入反應(yīng)室的亞相以開始反應(yīng)。如前所述，對數(shù)據(jù)進(jìn)行了相應(yīng)的分析[15,16]。活性顯示為單位時間、單位反應(yīng)室面積和"零級"槽中每毫升酶水解的底物摩爾數(shù)（摩爾數(shù)cm-2.min-1.mL-1）。所有分析測定均一式三份進(jìn)行。結(jié)果以平均標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）的形式清楚地呈現(xiàn)。